Espectrofotometria

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Espectrofotometría de absorción UV-visible

UN espectrofotometria se puede definir como cualquier técnica analítica que utiliza la luz para medir las concentraciones de soluciones, mediante la interacción de la luz con la materia.

La palabra espectro de origen griego se usó para nombrar rayos luminosos porque en la antigüedad la gente enterraba a sus muertos en fosas poco profundas, y el simple hecho de que una persona desprevenida se subiera a una de estas tumbas provocó la expulsión del gas metano. ya que los cuerpos en descomposición liberan varios gases, incluido el metano, que tiene una propiedad de autoinflamación con un aspecto luminoso intenso. Cuando alguien fue sorprendido por una bola de gas como esa, se asustó y dijo que estaba asustado por un fantasma que en griego es espectro.

Antecedentes de la espectrofotometría

La luz en general se describe mejor como radiación electromagnética debido a su naturaleza dualista. Es decir, existe y tiene un comportamiento de campos eléctricos y magnéticos oscilantes como lo representa la siguiente figura:

Dónde:

La longitud de onda (λ) es la distancia en metros, de un pico a otro de la onda;

A menudo (v) es el grado de oscilación de las ondas, en función de la velocidad de la luz en el vacío que está representada por la constante C (c = 2, 998×108metro. s-1). De modo que:

λ. v = c

Espectro electromagnético que representa las longitudes de onda correspondientes a cada radiación.

La técnica espectroscópica se basa en el aumento de energía debido al aumento de la frecuencia de la radiación impactada. Cuando una especie química absorbe energía en forma de fotones, sus electrones se excitan y se produce una transición de un orbital de menor energía a un orbital de mayor energía. Un ejemplo de esto son los compuestos químicos que tienen dobles enlaces C = C en el benceno y C = O, carbonilo, por ejemplo.

El aumento de energía está representado por la condición de frecuencia de Bohr:

E = hv

Dónde:

mi es la energía que aumenta con la frecuencia, y h es la constante de Planck h = 6,626×10-34Js

La transición electrónica de los dobles enlaces se produce porque un doble enlace está formado por un orbital sigma (σ) y un orbital (π), de modo que el electrón que está en el orbital pi del ligando va al orbital pi antiligante que tiene el mayor energía. (para obtener más detalles, consulte la teoría de orbitales moleculares). La transición en C = C está en C = O se representa en la siguiente figura, estas especies químicas se llaman cromóforos o sustancias que aportan color:

Para C = C : Pi-Pi*

Para C = O: (orbital no ligando) n-Pi*

Los aminoácidos como la Fenilalanina, la Tirosina y el Triptófano son los principales responsables de la absorción de luz de las proteínas debido a que tienen el anillo de benceno en su estructura química, además del enlace peptídico mencionado anteriormente. La luz se absorbe en el rango de 280 nm.

Lei de Lambert-Beer

La “fuerza vital” de la espectrofotometría se basa en la ley de Lambert-Beer, que establece:

“La absorbancia es directamente proporcional a la concentración de la solución de muestra”.

O:
Registro (I / I0) = εcl
A = εcl

Dónde :
A es absorbancia,
ε es el coeficiente de extinción molar y
l es la longitud de la cubeta.

Los principales componentes de un espectrofotômetro se presentan y sus respectivas funciones:

Fuente de luz: consta de una lámpara de deuterio y una lámpara de tungsteno (similar a una lámpara de automóvil). La lámpara de deuterio emite radiación UV y la lámpara de tungsteno emite luz visible.

Monocromador: algunos espectrofotómetros todavía tienen un prisma como monocromador, sin embargo los más modernos cuentan con dispositivos electrónicos que transforman la luz que cae en varias longitudes de onda, en una sola longitud, es decir, la luz monocromática.

Cubeta: es el recipiente adecuado para contener la muestra que se utilizará en el análisis, las cubetas pueden ser de cuarzo, vidrio y acrílico, sin embargo se recomienda utilizar una cubeta de cuarzo porque el vidrio y el plástico absorben los rayos UV y provocan reflejos luz visible.

Detector: el detector es un dispositivo que detecta la fracción de luz que ha pasado a través de la muestra y la transfiere a la pantalla y a la computadora conectada al dispositivo.

Análisis espectrofotométrico

Paso 1: la muestra debe prepararse rompiendo la muestra por métodos mecánicos, químicos o físicos;

Paso 2: la muestra se solubiliza en el disolvente elegido en un matraz aforado limpio y seco;

IMPORTANTE: el solvente más a menudo es agua, sin embargo, cuando se trata de muestras apolares que necesitan ser diluidas en solvente orgánico, nunca use alquenos, alquinos, cetonas o cualquier otro que tenga C = C o C = O o triples enlaces.

Paso 3: en una cubeta se coloca el solvente puro y se lee a la longitud de onda igual a la muestra a leer, este procedimiento se denomina lectura en blanco, y su propósito es minimizar los errores causados ​​por la absorción de luz provocada por el vidrio y el agua;

Paso 4: la muestra se filtra a través de una membrana de 0,2 μm, porque la solución debe ser completamente transparente para minimizar el error causado por las partículas en suspensión, la cubeta que contiene el blanco y se retira del equipo y se anota su absorción. Después de este proceso, se lee la solución de interés y se resta la lectura en blanco de esta absorbancia.

Cuidado de la espectrofotometría

  • Es fundamental que el equipo sea calibrado y manipulado según las instrucciones del fabricante, porque ya trae el margen de error que tiene el dispositivo;
  • Evite errores de lectura y asegúrese de que el equipo esté cerrado. Antes de leer, la luz ambiental puede interferir con el resultado;
  • Manténgalo siempre limpio y cerrado para evitar la acumulación de partículas de polvo que interfieran con el análisis. En ningún caso tocar la cubeta con las manos desnudas, nuestra mano contiene grasas e interfiere con la lectura.
  • Solo los compuestos que absorben la luz pueden analizarse mediante espectrofotometría de absorción.
  • En el caso de soluciones muy coloreadas como permangantes, complejos muy coloreados, dicromatos, cromatos y otros compuestos con colores muy acentuados, se deben realizar al menos 5 diluciones de concentración conocida y leer en el espectrofotómetro y se debe trazar una curva analítica para determinar el coeficiente de extinción molar. Las soluciones muy concentradas tienden a provocar errores de lectura porque hay muchas moléculas próximas entre sí.

Bibilografia:

Harris, Daniel C.; Análisis químico cuantitativo; traducción Carlos Alberto Riehl …[et al.].5.ed. LTC Editora, Río de Janeiro: 1999. cp.19,20,21.

Lenhinger, Albert Lester; Principios de bioquímica.3.ed. Guanabara Koogan, Río de Janeiro: 1992. cp.3.

Fundamentos de la química analítica – West, Donald M.; Holler, F. James; Skoog, Douglas A.

Jones, Loretta; Atkins, Peter Principles of Chemistry – Cuestionando la vida moderna y el medio ambiente – 3rd Ed-Porto Alegre: Bookman, 2006.